Workshops 3

Localización espacio-temporal de patrones de expresión génica mediante hibridación in situ.

José Luis Ferrán, Luisa Sánchez-Arrones y Matías Hidalgo Sánchez


“Procedimientos generales para elegir la región del mensajero más apropiada a ser utilizada como sonda de hibridación”
José Luis Ferrán

Contenido:
Análisis in sílico utilizando las principales herramientas informáticas (NCBI, Ensembl. UCSC, VISTA) para localizar regiones de mRNA como potenciales candidatas para la elaboración de sondas de RNA. Opciones a seguir una vez localizada la región de interés: adquisición de EST (ArkGenomics, Imágenes, etc.) o clonación en sistemas TA.

Se discutirán aspectos tales como tamaños apropiados de la sonda y ventajas y desventajas que supone la compra de un EST o la clonación del segmento de interés.


“Síntesis y purificación de la ribosonda. Métodos de obtención de embriones de pollo. Técnica de hibridación in situ in toto en pollo y ratón. Ventajas e inconvenientes”
Luisa Sánchez-Arrones

Contenido:
Síntesis de ribosondas marcadas con fluoresceína y digoxigenina; técnicas de precipitación, ventajas e inconvenientes. Obtención de embriones in toto mediante dos técnicas del cultivo; fijación y almacenamiento. Preparación de los embriones, antes de la hibridación. Hibridación in situ simple y doble en embriones de pollo, desde estadios tempranos del desarrollo, placa neural, hasta tubo neural cerrado. Hibridación in situ simple en embriones de ratón. Ventajas e inconvenientes. Procesamiento ulterior de los especimenes, para almacenaje o inclusión.


“Técnica de hibridación in situ en cortes de vibratomo. Ventajas e inconvenientes”
José Luis Ferrán

Contenido:
Planificación experimental para el estudio del patrón espacio-temporal de un gen. ¿Cuántos estadios de desarrollo y cuanto embriones deben ser analizados?. Fijación y almacenamiento del material (se hará referencia a pollo y ratón fundamentalmente). Aspectos generales sobre cómo preparar la muestra a ser cortada en vibratomo (elaboración del bloque de gelatina, tipo de gelatina a utilizar, orientación del bloque, etc.). Medios a utilizar durante la hibridación in situ. Doble hibridación in situ. Opción de inmunohistoquímica posthibridación. Montaje de cortes. Problemas frecuentes y su resolución.


“Hibridación in situ en secciones de criostato”
Matías Hidalgo Sánchez

Contenido:
Congelación del material.- El criostato: las claves de su correcta utilización y los errores más frecuentes.- Hibridación in situ sobre secciones de criostato: protocolo general y simplificado.- Cómo crear un protocolo específico de hibridación in situ.- Detección de problemas y sus posibles correcciones.